Ген vs антиген.

 Защита организма животных и человека от посторонних, потенциально опасных веществ зависит от реакции связывания «антиген - антитело». Данная реакция довольно специфична и зависит, в частности, от конформации молекул. Веществ, чужих для организма может быть великое множество. А организм может синтезировать лишь то, что записано у него в геноме. Появляется вопрос – «как же синтезировать такое множество антител, чтобы хватило на столь огромное множество антигенов?». В данной статье попробуем объяснить этот феномен.

 «Один ген — один фермент» — простая на глаз фраза и сложная по своему историческому пути. Джордж Бидл и Эдвард Татум были удостоены Нобелевской премии за сформулированную теорию «один ген — один фермент». В 1940 г. они изучали как гены обеспечивают метаболизм у микроскопического грибка Neurospora crassa. Ими были получены мутации, в связи с которыми у грибка отсутствовала активность того или иного фермента. Это приводило к тому, что мутантный гриб не был способен сам синтезировать определенный метаболит и мог жить только когда этот метаболит был добавлен в питательную среду. Данная теория надолго станет центральной догмой молекулярной биологии.
Однако 30-ю годами ранее детский врач сэр Арчибальд Гаррод обнаружил, что алкаптонурия вызывается повреждением одного рецессивного гена и болезнь проявляется, когда мутантный аллель находится в гомозиготном состоянии. Отсюда был сделан вывод, что повреждение одного гена вызывает отсутствие одной биохимической реакции. А раз биохимические реакции катализируются ферментами то, предположил сэр Арчибальд, ген предопределяет наличие активного фермента. Отсюда рукой подать до вывода «один ген — один фермент». Гаррод опубликовал свои результаты в медицинском журнале «Lancet», который генетики не читают.
В 1953 году Сеймур Бензер, американский генетик, изучал особенности рекомбинации между двумя различными мутантами бактериофага Т4, одновременно заражавших кишечную палочку Escherichia coli и предположил, что ген кодирует не целый белок, фермент, а какую-либо полипептидную цепь. Сами же белки могут состоять из множества подобных цепей. Причем этот кодируемый полипептид еще не обладает ферментными функциями, если конечно сам фермент не состоит из одной единственной полипептидной цепи.
Параллельно шла работа по открытию ДНК и ее функций. С этой работой, затянувшейся, в общем-то, на полвека, связаны имена Н. Кольцова, который первым высказал идею о передаче наследственной информации с помощью матричного копирования макромолекул, Ф. Гриффита и О. Эвери, и конечно Джеймса Уотсона и Френсиса Крика, а также многих других ученых. Становится ясным, что ген — это участок ДНК, в котором последовательность нуклеотидов определяет последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Кольцов, правда думал, что роль тех матричных молекул принадлежит белкам, но ведь важна сама идея, и понятно, что на тот момент не было высокоразрешающих методов, тогда считали, что белки более многообразны. Однако ведь сама идея! Кольцов думал над ней с 1893-го, с доклада Александра Андреевича Колли, который попытался вычислить сколько молекул помещается в живой клетке, например в сперматозоиде. По расчетам Колли, выходило, что мало. И получался парадокс — наследственных признаков много, а молекул мало. От Кольцова его идею привозит в Германию Тимофеев-Ресовский, где заинтересовывает молодого аспиранта физика Макса Дельбрюка, а Дельбрюк в свою очередь проносит ее сквозь года и передает ее своему аспиранту Джеймсу Уотсону.


История открытия антител тоже была долгой и постепенной. Вообще история иммунологии тянет на отдельную книгу. Много было гипотез и предположений. Много споров. Причем некоторые споры уходят корнями в далекое прошлое медицины и человечества в целом. Естественно, здесь нет возможности расписать всю удивительную историю человеческих мыслей, мы остановимся лишь на некоторых моментах.
В 1890 году Эмиль фон Беринг выделил вещество нейтрализующее в крови животных дифтерийный токсин. Токсин этот двумя годами ранее был получен Эмилем Ру и Александром Йерсеном. За свое открытие Беринг был удостоен Нобелевской премии по медицине. Вещество, открытое им, было названо антитоксином. Впоследствии весь класс подобных веществ стал называться более общим термином «антитело», а то, что их вызывает назвали антигеном. Позже было выяснено, что многие вещества, и не только бактериальной природы, вызывают иммунные реакции. С работой в этом направлении связаны имена Пауля Эрлиха, Жюля Борде, Ильи Ильича Мечникова.
Одним из предположений Эрлиха было то, что антиген и антитело, благодаря стереохимическим конфигурациям, реагируют по принципу «замка и ключа», т. е. как фермент-субстрат. Однако он считал, что молекулы просто присутствуют как боковые цепи на мембране клеток. Он считал, что антиген специфически отбирает антительные рецепторы, отрывая их от мембран клеток и это приводит к конденсированию антител в крови.
Дальнейшие работы Обермайера и Пика, а затем и Ландштейнера показали, что антитела образуются против почти любого искусственного химического соединения если его присоединить к белку. Стало казаться невероятным, чтобы организм мог вырабатывать специфические антитела против такого огромного количества чужеродных и даже искусственно созданных веществ. Гипотеза Эрлиха сильно пошатнулась. В качестве «признания работ по иммунитету» Пауль Эрлих вместе с Мечниковым, кропотливые и целеустремленные исследования которого открыли путь для теории фагоцитоза, награжден Нобелевской премией.
Многообразие антигенов и специфичность к ним антител будоражила умы ученых. После Эрлиха было выдвинуто множество гипотез возникновения антител.
В течении трех лет с 1955 года Ф. М. Бернет, Д. Толмедж и Дж. Ледерберг разрабатывают клонально-селекционную теорию образования антител. Прообразом данной теории стала гипотеза «естественного отбора» Нильса Йорне, который буквально переломил существовавшие в то время инструктивистские взгляды Брейнля, Гауровица и Полинга. Йорне и Бернет как и раньше Эрлих считали, что в организме действительно синтезируется полный набор антител, но каждое из них образуется в небольшом количестве и поступает в кровь независимо от какого-либо стимула. Бернет считал, что антитела присутствуют на поверхности клеток в качестве рецепторов, с которыми антигены могут вступать во взаимодействие. Это взаимодействие служит сигналом для пролиферации популяции клеток, отличающихся от остальных тем, что они специфичны именно к данному антигену. Он так же считал, что часть популяции этих клеток преобразуется в антителообразующие клетки, а часть остается как иммунная память.
Далее Гейдельбергер показал, что антитела являются белками. Вместе с Ландштейнером и Эвери они охарактеризовали антигенные детерминанты. В 1972 г. Р. Портер и Д. Эдельман расшифровали структуру антител. Фагреус и Кунс идентифицировали плазматические клетки как класс клеток, секретирующих антитела. Йорне обнаружил антиидиотипическую сеть, когда вырабатывающиеся антитела сами являются антигенами, такая сеть участвует в регуляции иммунного ответа.
В 1971 Бернет дополняет свою теорию предположением, что иммунная система контролирует генетическое постоянство внутренней среды организма. Он также предположил, что в эмбриогенезе происходит уничтожение клеток, способных реагировать на собственные ткани и иммунитет включается не только на чужие агенты, но и на свои клетки с измененным генотипом.
«За исследования по химической структуре антител» Роднею Портеру и Джеральду Эдельману присуждена Нобелевская премия. За открытие антиидиотипической сети Нильсу Йорне совместно с Джорджем Келлером и Цезарем Мильштейном присуждена Нобелевская премия. «За открытие приобретенной иммунологической толерантности» Франку Макфарлейну Бернету и Питеру Медавару присуждена Нобелевская премия.

На уровне сегодняшних знаний мы знаем, что антитела — это иммуноглобулины, гликопротеины, имеющие в своем составе центры специфического связывания антигенов. Связывание построено на принципах комплементарности. В связывании принимают участие электростатическое взаимодействие, водородные связи, силы Ван дер Ваальса и гидрофобные взаимодействия. Иммуноглобулины имеют как мембранную, так и секретируемую форму, растворимая форма и называется антителами.
Молекулы всех иммуноглобулинов состоят из тяжелой H (High) и легкой L (Light) цепей. Простейший иммуноглобулин содержит 2 тяжелые и 2 легкие полипептидные цепи, соединенные дисульфидными связями. Существует два вида легких цепей, каппа и гамма, но иммуноглобулины содержат либо 2 каппа, либо 2 гамма цепи. Тяжелых цепей у человека 9 видов, по ним иммуноглобулины разделяются на пять классов и подклассы, изотипы.
Как легкие, так и тяжелые цепи включают в себя вариабельный домен и несколько константных. Иммуноглобулины, продуцируемые разными клонами плазматических клеток, имеют разные по аминокислотному составу вариабельные домены. Легкие цепи содержат 1 вариабельный и 1 константный домен, тяжелые цепи имеют 3-4 константных домена и также 1 вариабельный. В формировании центра связывания (активного центра) принимают участие вариабельные домены обоих видов цепей. Константные домены участвуют в связывании с белками системы комплемента, лейкоцитами и в других эффекторных функциях.
По самым скромным подсчетам природное разнообразие иммуноглобулинов примерно 10 в 16-й степени видов. Геном человека содержит всего 23,5 тысячи генов. Как же быть? Природа нашла выход. Клетки содержат не уже готовый геном, а своеобразный конструктор, генные сегменты, из которых в созревающих В-лимфоцитах собираются нормальные гены.
В геноме человека тяжелые цепи кодируются тремя видами генных сегментов, V (variable — вариабельный), D (diversity — обеспечивающий разнообразие) и J (joining — соединительный). У человека 51 Vh-сегмент, 27 Dh-сегментов и 6 Jh-сегментов, а также несколько С-сегментов, кодирующих константные домены. Схожим образом кодируются и легкие цепи. Например, для каппа цепи — 40 Vк-сегментов, 5 Jк-сегментов и 1 С-сегмент. D-сегментов нет.
В ходе созревания В-лимфоцитов, генные сегменты подвергаются перестройке, случайным образом объединяется по одному V, D и J сегменту (V и J для легких цепей). Перестройки идут только в одной из хромосом, тем самым создается аллельное исключение, результатом которого является неспособность одной В-клетки продуцировать иммуноглобулины с разными активными центрами. Неудачные комбинации отсеиваются путем апоптоза клеток.
За открытие механизмов формирования разнообразия антител Судзуми Тонегава в 1987 году был удостоен Нобелевской премии.


Около 35 лет прошло со времен работ Келлера и Мильштейна и получения ими первых моноклональных антител, антител одного вида, специфичных против одного определенного антигена. Подобные антитела могли бы быть использованы при лечении многих инфекционных, аутоиммунных, сердечно-сосудистых заболеваний, препараты с ними могли бы помочь также и в трансплантологии.
Первые попытки применить мышиные моноклональные антитела закончились, по сути дела, неудачей. Полученные молекулы имели низкую аффинность (прочность связывания активного центра с конкретным эпитопом антигена), высокую иммуногенность, были неспособны задействовать систему комплемента и системы клеточного иммунитета в чужеродной системе.
Сегодня, благодаря генной инженерии потенциал иммуноглобулинов постепенно реализуется. На сегодняшний день известно около 30-ти препаратов содержащих в своей основе иммуноглобулины, 90% из которых применяются в онкологии. И многие препараты находятся уже на стадии клинических испытаний.
Генная инженерия позволяет не только регулировать такие показатели иммуноглобулинов как аффинность, иммуногенность, оптимизировать эффекторные свойства, но и, например, создавать составные молекулы, молекулы антител, включающие другие антитела, другой специфичности, или же радиоизотопы, белковые токсины, ферменты, цитокины, флуоресцентные белки. Также возможно получать различные производные антител, это могут быть как полноразмерные одноцепочечные антитела, так и различные укороченные варианты — димеры и мономеры Fab фрагментов (различные протеолитические ферменты расщепляют иммуноглобулины на фрагменты, например, сериновая протеиназа папаина расщепляет молекулу на Fab, fragment antigen binding, в который входят вся легкая цепь и Vh, Ch1 домены тяжелой цепи и который сохраняет способность связывания антигена; и Fc, fragment cristalizable, в который входят остальные константные домены тяжелой цепи), однодоменные антитела.
Искусственные иммуноглобулины уже применяются в радиоиммунотерапии для доставки радиоизотопов к мишени. Только начинается применение биоспецифических иммуноглобулинов в клеточной иммунотерапии. Например, изменчивость раковых клеток и их резистентность к терапии вынуждает применять различные по механизмам действия препараты и методы лечения, здесь могли бы помочь искусственные антитела, одновременно поражающие несколько мишеней или же блокирующие сразу несколько метаболических путей. Не стоит также умалять значение Fc фрагментов антител, они отвечают за эффекторные функции и способствуют привлечению в патологический очаг других защитных систем самого организма. По этим направлениям открывается большой простор для экспериментальных и клинических исследований. Это дело будущего.

Салихов Тимур, 2009 г.